2013/4/7 0:00:00
摘要探讨了影响时间分辨单光子荧光谱仪时间分辨率的因素,组装和调试了三种类型的时间相关单光子荧光谱仪,测定了它们的激发光脉冲响应函数,提出了测定时间分辨率的方法,并测定了时间分辨率。物质被脉冲光激发后,其发光强度随时间的变化函数f(t)是完全由物质本身性质决定的,它显示该物质的时间分辨光谱。与稳态光谱相比,时间分辨光谱为光谱学增添了两个独立的光谱参量:寿命Tf和旋转弛豫时间Tr。Tf定义为激发态粒子在激发态的平均滞留时间,它表征激发态粒子数随时间的变化,Tr表征偶极矩或极化强度各向异性随时间的衰减[1]。Tf,Tr及其对应项的指前因子包含着有关物质组成、分子结构,能量传递途径、顺序及效率的丰富信息。时间分辨光谱为研究快速变化过程如光合作用,视觉过程的中间产物提供详细信息。寿命测量用于研究物质内部无辐射跃迁过程的性质和能量传递[2]。旋转弛豫时间可用于推测分子的形状、大小、大分子的流动性、所处微环境与分子间的相互作用。
我们曾研制成功带闸控纳秒光源的时间相关单光子荧光谱仪NSY-1[4]、激光时间分辨荧光谱仪[5]。为国内第一台进口的时间相关单光子荧光谱仪SP-7进行了升级改造。为生物大分子国家重点实验室,分子动态和稳态结构国家重点实验室组装和调试成功激光时间相关单光子荧光谱仪。本文介绍了当前最常用的时间分辨荧光谱仪:时间分辨单光子荧光谱仪。论述了决定仪器时间分辨率的因素,为组装设计提供参考。测定了仪器对激发光的响应函数。测定了自定义的时间分辨率。
1 仪器装置及工作原理
近三十年来,单光子时间分辨荧光谱仪的性能提高很快。在脉冲光源方面,从闸控光源到脉冲激光,从纳秒激光发展到飞秒激光,每十年变化三个量级。在检测系统方面也发生了重大变化。图1给出了时间相关单光子荧光谱仪的框图。表1列出了不同类型设备和性能上的主要差别以及相应整机的参改价格。仪器的性能价格比主要取决于光源和探头。仪器的工作原理为:探测器D1接受脉冲光产生电脉冲,信号通过放大器(AMP1)放大后到恒分甄别器(CFD1)定时,作为光启动时刻去起动时间幅度转换器(TAC)产生一个斜坡信号;脉冲光的另一束通过波长选择后去照射样品,样品荧光通过单色仪后被信号探测器D2检测产生光电信号,通过放大器(AMP2)放大后到恒分甄别器(CFD2)定时,作为荧光信号去终止时幅转换器(TAC)转换。这样时幅转换器送出的斜坡脉冲信号高度正比于终止信号与起始信号之间的时间差(时间相关)。将信号送到脉冲幅度多道分析器(MCA)中记录并储存。通过很多次闪光,可得到一个累加探测到的荧光信号数(次数)随脉冲高度(多道道数即时间)的分布曲线。在每次闪光时,信号光电倍增管最多只能接收到一个荧光光子的条件下(单光子检测),这分布曲线反映被测物质的荧光衰减曲线。通过计算机解卷积处理,可得到荧光寿命及其指前因子。
2 仪器时间分辨率的估计
仪器的时间分辨率Tr取决于测时的不稳定性或者说是定时的误差,则TR∝TP*TD1*TA1*TC1*TD2*TA2*TC2*TT*TM即为各部分时间不确性的几何相加,其中TP代表光脉冲宽度的变化及前沿的不稳定性,TD1,TD2分别代表探测器D1和D2光脉冲响应上升前沿的时间抖动(Walk time)TA1和TA2分别代表放大器1和2前沿响应的不稳定性,TT代表时幅转换高度的不稳定性,TM代表多道分析器道不稳定性(道漂)与道宽之积。由于电子学的高速发展,从性能和价格上来说,可以容易地选择合适型号的放大器、时幅转换器和多道分析器以满足我们的设计要求,并在实验过程中合理地选择时幅转换器的转换量程,从而得到合理的多道分析器的时间道宽来减少线路单元带来的误差。
当电极间距从0.5mm~3mm时,闸控氢灯光脉冲半宽约1~5ns之间,氮灯在2~7ns之间,宽度还与所加放电高压、闸控重复频率有关。通过累计平均和解卷积,可将宽度的影响缩小50倍(在单寿命测量时)。
当利用锁模激光时,染料同步泵浦出来的光脉冲为几个皮秒,即便倒空后宽度也只增加到20~30皮秒。因而通过累计平均、解卷积处理后,激光脉冲宽度和宽度变化对时间分辨率的影响甚微。
用于时间测量的光电倍增管输出脉冲的上升前沿约2ns,其前沿时间抖动约为0.2ns。
微通道光电倍增管的输出脉冲上升前沿约0.2ns,其前沿时间抖动约20PS。因而在用闸控光源和光电倍增检测的单光于荧光谱仪中,时间分辨率主要受光电倍增管的前沿抖动时间和脉冲光源宽度及宽度变化的影响。
在用激光光源和光电倍增管的单光子谱仪中,时间分辨率主要由光电倍增管的前沿抖动决定。在用激光光源和微通道光电倍增管的单光子时间谱仪中,其时间分辨率由微通道光电倍管的前沿抖动和恒分甄别器的定时精度决定。
通过合理的设计和调试,可以使各单元仪器实际时间分辨率优于其标称的时间分辨率,从而提高整机的时间分辨率。
3 实验结果和讨论
图2给出了不同类型单光子荧光时间谱仪测定
的脉冲光响应函数(俗称“灯”谱),它包含了激发光脉冲、光探测器响应和仪器电子学响应的影响。曲线a为皮秒激光脉冲激发,微通道光电倍增管R2809U检测得到的“灯”谱,半高宽约100PS。曲线b为飞秒激光激发,光电倍增管XP2020Q检测得到的激光响应函数曲线,其半高宽近1ns。曲线C为299T型单光子荧光谱仪的“灯”谱,其激发光源为闸控氢灯(电极间距0.7mm),检测探头为XP2020Q。曲线C的半高
宽为1个多纳秒。曲线d为NSY-1的“灯”谱,与SP-7的“灯”谱一致。其激发光源为闸控氮灯(电极间距3mm),检测探测器为GDB49(或XP2020Q)。曲线d半高宽为7ns。可见曲线a主要取决于R2809U(前沿上升时间150PS)。曲线b主要受XP2020Q影响。线C除受XP2020Q的影响外,还受到闸控光源的影响。而曲线d主要是由闸控脉冲光源决定。我们定义测得的仪器激发光响应函数自解卷积所得寿命值为仪器的时间分辨率,它代表仪器对激发光响应随时间的不确定性。对应曲线a自解卷积的结果优于10ps,曲线c优于100ps,曲线d优于200ps。图3给出曲线b自解卷积结果,优于80ps。