液相色谱仪分析系统的洗脱方式和注意要点

液相色谱仪有等强度洗脱和梯度洗脱两种方式。等度洗脱是指实验过程中（做样过程）从头到尾只用一种流动相。也就是只用一个泵，输送同一种流动相。梯度洗脱是指在同一个分析周期中随着时间的变化按一定程序梯度性地改变洗脱液的比例(浓度配比、成分、离子强度、溶液极性等)或pH，以期将层析柱上不同的组分洗脱出来的方法。从而可以使一个复杂样品中性质（极性）差异较大的组分能按各自适宜的容量因 子k达到良好的分离目的。梯度洗脱一般分为二元高压梯度，二元低压梯度和四元低压梯度；二元高压梯度需要两台高压泵，二元低压梯度和四元低压梯度都是只需要一台高压泵和一个比列阀。

两种溶剂组成的梯度洗脱可按任意程度混合，即有多种洗脱曲线：线性梯度、凹形梯度、凸形梯度和阶梯形梯度。线性梯度最常用，尤其适合于在反相柱上进行梯度洗脱。

在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此带来一些特殊问题，必须充分重视：

①要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相，有些溶剂在一定比例内混溶，超出范围就不互溶，使用时更要引起注意。当有机溶剂和缓冲液混合时，还可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。

②梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证良好的重现性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来。用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止混合时产生气泡。

③混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。例如甲醇和水粘主度都较小，当二者以相近比例混合时粘度增大很多，此时的柱压大约是甲醇或水流动相时的两倍。因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱能承受的最大压力。

④每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡。